Otto Mueller hob in seiner Kunst vor allem die Einheit von Mensch und Natur in den Vordergrund. Aktdarstellungen in Landschaften zählen neben Darstellungen aus seiner „Zigeuner-Mappe“ zu seinen häufigsten Motiven. 

1890 begann er eine Lithografenlehre. Nach seinem Abschluss schrieb er sich 1894 an der Kunstakademie in Dresden ein, wofür er eine Sondergenehmigung erhalten hatte. Auf Grund von Differenzen mit seinen Lehrern Hermann Freye (1844-1921) und Carl Bantzer (1857-1941) verließ er die Akademie nach zwei Jahren. 1898 zog er gemeinsam mit Paul Kother (1878-1963) nach München um. Dort wollte er die Akademie der Bildenden Künste besuchen. Jedoch wurde er nicht in die Klasse von Franz von Stuck (1863-1928) zugelassen, woraufhin er begann sich autodidaktisch weiterzubilden. Besonders die Werke von Hans von Marées (1837-1887) und Arnold Böcklin (1827-1901) stellten für ihn eine große Inspirationsquelle dar.
1899 kehrte er nach Dresden zurück und verkehrte dort vermehrt im Kreis der Elbier, eine Dresdner Künstlergruppe unter Gotthard Kuehl (1850-1915), die die Nachfolge der kurz zuvor aufgelösten Dresdener Sezession bildete. Weitere Mitglieder der Gruppe waren unter anderem Ferdinand Dorsch (1875-1938), Walter Sintenis (1867-1911) und Josef Goller (1868-1947).
1908 zog er ein weiteres Mal um. Diesmal nach Berlin. Dort fand er neue Inspirationsquellen für seine Kunst. Besonders Wilhelm Lehmbruck (1881-1919) beeindruckte ihn. Nach seinem Vorbild veränderten sich Muellers Mädchengestalten. Ab diesem Zeitpunkt bekamen sie ihre, für ihn typische, schlanke Figur. Auch seine charakteristische Leimfarbe und die gedämpfte Farbgebung lassen sich auf diese Zeit zurückführen.
Während seiner Zeit in Berlin versuchte er sich vergeblich der Berliner Sezession anzuschließen. Nach mehrmaligem Scheitern gründete er mit anderen abgewiesen Künstlern, wie Max Pechstein (1881-1955), die Neue Sezession. So kam er auch in Kontakt mit der Künstlergruppe „Die Brücke“.
Nach Kriegsende wurde er an die Staatliche Akademie für Kunst und Kunstgewerbe in Breslau berufen, wo unter anderem Emil Bartoschek (1899-1969) und Walter Kalot (1909-1996) zu seinen Schülern zählten. Dort verkehrte er im Kreis der „Breslauer Künstlerbohème“ und lehnte jegliche bürgerliche Anpassung ab.
1924 reiste er gemeinsam mit seiner Frau nach Dalmatien, wo er bei „Zigeunern“ unterkam. Für einige Zeit lebte er unter ihnen und fügte sich in ihre Kultur ein. Auch künstlerisch setzte er diese Erfahrungen um. In seiner „Zigeunermappe“, die sich aus zehn Lithografien zusammensetzt, dokumentierte er das Erlebte. Sie gehört auch heute noch zu seinen bekanntesten Werken.
Auch 1928 unternahm er weitere Reisen, unter anderem nach Paris, Rumänien und Bulgarien.
Die Einfachheit der Komposition und gleichzeitige Konzentration auf den Menschen machen seine Werke aus. Anfänglich noch rundere Formen werden im Laufe der Zeit immer spitzer und länger.
Ein weiteren Charakteristikum seiner Werke sind seine schwarzen Umrisslinien, mit denen er seine Motive hervorhebt. 

Auch heute noch zählt Mueller zu den bekanntesten Künstlern der expressionistischen Moderne.