Sofonisba Anguissola gehört zu den ersten berufsmäßigen Malerinnen der Renaissance. 

Da beide ihrer Eltern zu aus dem Handelsbürgertum stammenden adligen Familien Cremonas gehörten, erhielt sie schon früh eine künstlerische Ausbildung. Mit 10 Jahren begann sie Unterricht bei Bernardino Campi (1522-1591) und Bernardino Gatti, genannt Il Sojaro, (1495-1576) zu nehmen. Aufträge holte in dieser Zeit ihr Vater für sie ein. Dafür unterhielt er Kontakte zu angesehen Künstlern der Zeit, unter anderem Michelangelo (1475-1564). Da sie als Porträtmalerin schnell bekannt wurde, erhielt sie 1559 auf Empfehlung des Herzogs von Alba einen Ruf an den spanischen Hof, um dort Philipp II. und seine Familie zu malen. Als Hofdame unterrichtete sie zudem die 14-jährige Elisabeth von Valois. Dieser fühlte sie sich auch emotional sehr verbunden, sodass sie 1568, nach deren Tod, in eine Depression verfiel und um ihre Entlassung bat. Vertraglich hatte sie mit dem spanischen Hof vereinbart, dass dieser sich um eine standesgemäße Hochzeit kümmern muss. So heiratete sie den Adligen Fabrizio di Monicada und zog zu ihm nach Sizilien. Nach dessen Tod kehrte sie nach Spanien zurück. Auf ihrer Heimreise lernte sie Orazio Lomellini kennen, in den sie sich verliebte und den sie heiratete. Gemeinsam mit ihm siedelte sie nach Genua über, wo sie begann Malunterricht zu geben. 
1606 wurde sie dort unter anderem von Peter Paul Rubens (1577-1640) besucht, der ihm Auftrag des Herzogs von Mantua einige ihrer Gemälde kopiert hatte. 
In ihren späteren Jahren konnte sie wegen eines Augenleidens und Rheumatismus keine Werke mehr fertigen. 

Anguissola war vor allem als Porträtmalerin bekannt. Alltags- und Genreszenen gehörten jedoch ebenso zu ihrem Sujet. Ihr wohl bekanntestes Gemälde ist „Drei Schwestern beim Schachspielen“ (1555). Es gehört zu den ersten Alltagsszenen in der italienischen Malerei. Neben der spanischen Königsfamilie porträtierte sie zahlreiche weitere spanische und italienische Adlige. Sie erfreute sich so großer Beliebtheit, dass einige ihrer Werke von Papst Julius III. und Pius IV. für die Sammlung im Vatikan angekauft wurden. 
Stilistisch orientierte sie sich vor allem an der emilianischen und lombardischen Malerei, vor allem am Stil eines Correggio (1489-1534) und Parmigianino (1503-1540).